Subject headings digestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
在恶性肿瘤的各种基因治疗中，自杀基因(suicide gene)/前药(prodrug)系统备受关注. 目前已在多种肿瘤进行大量临床前研究，有的已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验. 该疗法对消化系肿瘤的治疗作用，业已得到证明［1］. 不管哪一种自杀基因/前药系统，均需有下列3个成分：①能编码一种酶的自杀基因：该基因通常来源于病毒或真核细胞，其编码的酶能将无毒的前药转变为活性毒物，引起靶细胞死亡；在缺乏前药的条件下，该种基因的表达对机体无害；该基因编码的酶对基质(前药)应具有高度催化效能(高Kcat)［2］. ②基因转移载体(gene-transfer Vectors)：为了转移自杀基因至靶细胞，一般采用基因工程改造的逆转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相关性病毒(adenovirus-associated viruses)作为载体［3］. 也有人采用阳离子脂质体作为载体，发现其对内皮细胞有高度亲和力［4］. 基因转移的关键是其靶向性(targeting)［5］. 如将甲胎蛋白(AFP)启动子和清蛋白增强子(Alb)TRS连接自杀基因，则后者便仅于表达AFP的肝癌细胞中表达，而不影响正常肝细胞［6］. ③能被自杀基因编码的酶作用的前药(prodrug)：这种前药在自杀基因不存在时，对机体无毒或仅有微小毒性，而在自杀基因编码的酶特异性作用下，前药转化为活性药物，后者的细胞毒性较无活性的前药至少强100倍.
1 自杀基因/前药系统
1.1 单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-tk/GCV)系统 表达单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纤维细胞，对戊环鸟苷(ganciclovir, GCV)的敏感性较野生型细胞强1000倍，在BALB/c小鼠，给予GCV，可使表达HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退缩. 上述发现奠定了HSV-tk/GCV系统的基础. GCV本身无毒性，在HSV-tk作用下，变成GCV单磷酸盐(GCV-MP)，再经内源性细胞激酶作用，迅速转化为其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸盐(GCV-TP)，后者对增殖中的哺乳细胞具有高度毒性. 虽然哺乳动物细胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的转化，但HSV-tk的作用比其强200倍. GCV-TP具有羟基，能插入DNA链中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳定［7］；GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶，进一步阻止DNA合成［8］. 在暴露于GCV后，表达HSV-tk的哺乳动物细胞内迅速聚集GCV磷酸盐，而未表达HSV-tk的野生型细胞则无GCV磷酸盐测得；将HSV-tk转染的细胞与3H标记的GCV一起孵育，发现放射性标记物迅速而稳定地掺入细胞DNA内. 应用IH核磁共振分光镜检测，发现肿瘤组织在HSV-tk/GCV治疗后，含胆碱物质的显性弥散系数减少50%，而迅速弥散性水成分的显性弥散系数增加219%，细胞内粘滞度明显增加，而大分子物质的流体动力学面积可能减少［9］；动力学分析显示细胞内P53蛋白水平先增加，继之cyclin β1蛋白水平升高，细胞周期中止于S/G2［10］. 上述事实说明HSV tk/GCV引起肿瘤细胞凋亡. HSV-tk/GCV系统不仅能杀灭表达HSV tk的细胞，且具有显著的旁观者效应(bystander effect, BSE).
无论是体外抑或体内实验均观察到，GCV剂量越大，培养中的HSV-tk+细胞被杀灭的比例和肿瘤退缩率也越高，荷HSV-tk+瘤的动物生存期也越长. 至于HSV-tk本身的表达水平，一般与对GCV的敏感性不具有相关性，但不完全如此. 此外，细胞对HSV-tk/GCV的敏感性尚取决于担负着GCV二-和三磷酸化的细胞激酶的活性、细胞增殖速率以及将GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性［11］. 有人认为，GCV被HSV-tk+细胞摄取较慢，亲和力较差，不是很理想的HSV-tk基质［12］. Balzarini et al［13］发现，Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代谢物在HSV-tk+细胞内停留时间较GCV代谢物长1倍以上，且E-GCV在血浆中较GCV稳定，因此如用作HSV-tk系统的前药，其作用至少比GCV强10倍；Tong et al［14］发现，如果用无环鸟苷(acyclovir, ACV)代替GCV作为前药，并使用较GCV常用剂量高2.5～5.0倍的剂量，则引致的旁观者效应明显高于应用GCV作为前药时.
1.2 带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系统 与HSV-tk不同，带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase， VZV-tk)对GCV亲和性甚弱，而对前药阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脱氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2＇-deoxyuridine ,BVdU)具有亲和力，能选择性催化二者磷酸化，再在细胞内酶作用下，最后生成三磷酸盐，分别为Ara-ATP和BVdU-TP［15］. 野生型细胞对高达1500μmol/L浓度的Ara-A和75μmol/L～250μmol/L浓度的BVdU均不敏感，而对表达VZV-tk的细胞，低至1μmol/L～100μmol/L浓度的Ara-M和0.06μmol/L～0.6μmol/L的BVdU即呈细胞毒性［16］.
1.3 胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系统 胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大肠杆菌和某些霉菌表达的一种酶，不存在于哺乳动物细胞内，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌药5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)经CD脱氨后，生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)，再经细菌内酶作用，生成氟脲嘧啶三磷酸盐(5-fluoro-5＇-trip hosphate)和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐(5-fluoro-2＇-deoxyuridine-5＇-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase)，阻抑DNA，RNA和蛋白合成，引致细胞死亡. 一般选用大肠杆菌的CD基因作为自杀基因. 应用5FC作为前药，有不少优点，例如，人的细胞酶不能使5FC脱氨，因此在通常剂量下5FC几无毒性；口服吸收良好(＞80%)；能透过血脑屏障等［1］. 表达CD的哺乳动物的细胞在暴露于5FC后. 细胞内迅速产生可测定水平的5FC，胸苷酸合成酶受抑，广泛形成RNA皱缩物(RNA adduts). 由CD/5FC介导的细胞死亡发生较HSV-tk/GCV引起者为慢［17］，可能由于5FC被摄取和转化较慢所致. 但CD/5FC引起的细胞杀死作用不一定弱于HSV-tk/GCV，主要由于前者往往有更强的旁观者作用. 如同HSV-tk/GCV一样，前药5FC的细胞毒性作用也呈现剂量相关性，在某些敏感的细胞系如结肠癌，细胞毒性与CD表达呈正相关［18］，但在对5FU不敏感的肉瘤细胞，此
