副溶血性弧菌直接溶血毒素基因原核表达载体的构建

　　副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种能引起食物中毒和旅游者腹泻的嗜盐性细菌。直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)是其主要的致病因子。本研究通过构建tdh基因原核表达载体，并实现表达，以获得与天然抗原结构接近的重组抗原。

　　构建重组质粒tdh/Trc99A经酶切及PCR鉴定。转化大肠杆菌JM109后得到重组菌tdh/Trc99A/JM109(命名为NWⅡ)。取10ml NWⅡ过夜饱和生长菌加入1000ml LB-Amp+，37℃培养至菌液A600=0.6时，迅速将培养温度降至30℃，并加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养6h。5000r/min低温离心10min，分别收集上清和沉淀，沉淀经超声波破碎，12000r/min低温离心10min，收上清。按35g硫酸铵/100ml上清进行沉淀，4℃透析过夜后做SDS-PAGE分析。取诱导前、后的NWⅡ、Trc99A/JM109、副溶血性弧菌培养液10μl点于Wagatsuma氏琼脂培养基平皿上，37℃培养过夜。

　　重组质粒经过双酶消化，能切割出约600bp的片段，PCR能扩增出约600bp的片段。SDS-PAGE凝胶薄层扫描显示，在30℃、IPTG诱导的培养条件下，重组菌NWⅡ的tdh基因得到表达，表达产物的相对分子质量约为21×103，表达量占菌体总蛋白的13.4%。重组菌NWⅡ在Wagatsuma含血琼脂平皿上呈现典型的β-溶血环。

　　副溶血性弧菌的TDH由2条相同氨基酸链组成，每条氨基酸链由567个碱基编码成189个氨基酸，其中前24个氨基酸为信号肽，后165个氨基酸为功能区。在构建tdh/Trc99A时，设计的PCR引物的5′端分别添加了1个起始密码子和2个终止子，能扩增出编码该毒素功能区和信号肽的目的基因片段，重组质粒的酶切和PCR扩增结果予以证实。SDS-PAGE和溶血试验表明表达蛋白以可溶性形式存在，纯化时无需经过变性和复性过程，能保证其生物学活性。通过实现tdh基因的原核高效表达，旨在大规模获得基因工程生产的TDH抗原，为阐明该毒素的结构和功能奠定一些基础；同时制备抗TDH单克隆抗体，用于副溶血性弧菌的现场检测。采用与TDH天然抗原结构接近的重组蛋白制备单克隆抗体，将有利于提高检测的敏感性和特异性。