脊髓损伤基因治疗的研究进展

1990年美国首次成功地进行腺苷脱胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治疗（ gene therapy）以来，基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一［1］。基因治疗在脊髓损伤（ spinal cordIn-jury， sCI）后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶细胞（包括神经元）中的表达，以改变神经元某些内在特性，从而进一步探索 sCI后神经元的存活能力，再生特性和功能恢复的分子机理，最终为 sCI的治疗探讨新途径是目前治疗 sCI的研究方向。它有助于把 sCI治疗提到一个新的水平。值得我们进一步研究。

　　一、 sCI基因治疗有关分子生物学基础

　　基因转移（ gene transrer）是实现基因治疗的关键技术［6］。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因 cDNA，启动子／增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰，翻译起始，内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子／增强子，一般有三种：强组成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及组织持异型启动子（ tissuesepcific），其中最常用为第一型［7］。理想的体内基因转移载体要求：转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于 sCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以对插入的外源基因进行有效转录，这样先在体外构建反转录病毒前病毒 dNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域（ gag， polenv基因区域），产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列（即顺式作用区域）。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，载体 dNA将依靠其 lTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达［2、3、6、7］。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用阳离子脂质体直接注入 cNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对 cNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体一聚乙烯亚胺（ polyetnyl－ enimine）业已用于基因转移［10］。另有 selle［6］（1993）等报道的复制缺陷腺病毒也是一种适用于神经系统的理想载体。

　　在 sCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准［4、6］：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力。③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于 sCI试验有雪旺氏细胞（ schwann cell， sC）和成纤维细胞［2、3、11］。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至 cNS至少可活6个月，且无肿瘤源性［12］。

　　基因治疗的实施，有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全，高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法（ exvivo approach）和在体法（ invivo approach）。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏 nTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS损伤。

　　在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移，效率较低，故较少采用。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效的控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到 cNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。

　　二、基因治疗 sCI的现状和展望

　　基因治疗 sCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用 nTF基因修饰雪旺氏细胞（ sC）或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况［2、3、11］。 tuszyski（1994）［11］将 nGF基因导入培养的 sC内，再将 sC移植到损伤的脊髓，发现 sC在体内能稳定地表达 nGF并促进轴突的再生。同年 tuszynski等［2］利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的 nGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纤维细胞仍能表达 nGF，电镜及免疫组化（ cGRP）检查，发现有大量的脊髓轴突再生（感觉纤维）。1996年， tuszynski等［3］采用同样方法，又将 nGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通过 rT— pCR技术鉴定成纤维细胞仍表达 nGF。电镜、免疫组化（ gFAP、 cHAT、 tH、5— hT， cGRP）检查发现有大量的（感觉和运动）轴突再生。作者在国际上首次构造 po—5＇— flanking介导的21.5KD髓鞘碱性蛋白微基因（暂命名为 pSVPoMcat）的基础上，通过阳离子脂质体导入 sC中，然后再将基因修饰的 sC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对 sCI的再生修复作用，现已发现 pSVPoMcat微基因修饰 sC对 sCI后细胞凋亡有抑制作用［13］。

　　当然利用基因转移技术治疗 sCI，目前还存在一些尚待解决的问题，第一是免疫排斥反应［6］，即宿主移植细胞的免疫排斥。因为尽管 cNS的免疫应答能力微弱，但对抗原较强的或种属相关较远的受体细胞，仍具有免疫排斥反应，因此，在细胞移植时应给予免疫抑制剂，最好使用自体工程细胞移植。亦可采用免疫隔离（ immuno isolation）法即使用微囊包膜（ mincroencapsulat）的工程细胞［14］。第二是移植细胞的长时间存活问题。因为在细胞移植部位，宿主内源性细胞系统对局部组织损伤的病理生理反应过程可能使部分移植细胞死亡。如果移植入外来组织细胞的体积较大，还可能对宿主组织及细胞产生机械性挤压，从而影响其结构与功能的完整性，因此，在移植方式上应该使用微移植（ microtransplantation， mit）技术。 nikknak（1994）［15］曾采用外径仅50～70μ m微管的点移植量为0.2μ l，而细胞密度很大（每微升达125.0个），达到以尽可能小的量，移植尽可能多的细胞则对宿主造成的创伤亦小。第三是遗传修饰细胞移植后转移基因的表达可能会随着时间的延长而逐渐下降，以致失去治疗作用。故而利用内源性或外源性调节因子主动调节转移基因的表达极为重要［15］。

 　　综上所述，在 sCI的再生修复治疗中，尽管基因转移所取得的结果均来自实验报告，但却具有十分诱人的临床应用前景。随着分子生物学的发展，我们可以把有丝分裂促进剂的基因插入在成熟神经元的基因组、成熟神经元便有可能一改不能分裂的状态而变为能够自行繁殖并再生修补损伤所造成的缺损，从而使脊髓组织象外周神经那样具有生长愈合的能力［6］。就目前情况而言，我们完全可以将对神经再生有利的基因（如 nGF基因）导入自体工程细胞（如 sC）以增强其功能，进一步促进脊髓的再生进而恢复功能。如此，则脊髓横贯截瘫病人重新站起来的愿望，将有可能成为现实。