弥漫性星形细胞瘤分子生物研究的新进展

　　肿瘤的形成和发展与基因改变间的关系是近年来肿瘤学研究的核心问题之一。大量的研究证实，肿瘤的形成起源于单个获得了癌基因和（或）抑癌基因改变的细胞；肿瘤的发展（包括由分化较好的肿瘤转变成分化差的肿瘤，局部浸润和远处转移）则是更多癌基因和抑癌基因受累后作用叠加，肿瘤细胞克隆选择和扩增的最终结果。

　　胶质瘤是成人最常见的脑瘤，其中以弥漫性星形细胞瘤（diffuse astrocytomas）最多见。1993年WHO脑肿瘤分类将弥漫性星形细胞瘤分成3级；星形细胞瘤（astrocytoma, WHO Ⅱ级），间变型星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma, WHO Ⅲ级）和胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, WHO Ⅳ级）。WHO分类为弥漫性星形细胞瘤的临床治疗和预后估计提供了可靠的依据，而近年来的分子生物学研究则进一步加深了我们对这一肿瘤发生发展的病理机制的认识。

　　常见于星形细胞瘤的3个基因改变分别是：p53基因的失活、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor， PDGF)与其受体的激活和22号染色体长臂的丢失。

　　p53基因编译的p53蛋白对细胞的继续生长或死亡起着决定性的作用。星形细胞瘤p53基因失活的主要机制为基因突变和p53基因位点染色体片段的丢失。p53基因突变以错义突变最常见，星形细胞瘤p53基因的突变热点也集中在密码子175、248、和273。基因的错义突变使其编译蛋白的氨基酸残基产生置换。突变型p53蛋白氨基酸序列的改变直接影响了它结合DNA，继而影响调节基因表达的能力。大量研究发现的30%弥漫性星形细胞瘤（WHO分类Ⅱ～Ⅳ级）有p53基因的突变和p53基因位点的丢失［1］。在关于复发型星形细胞瘤的最新研究中又进一步发现，部分间变型星形细胞和胶质母细胞瘤是由WHO分类Ⅱ级的星形细胞瘤复发并发生恶性转变而形成。在这组复发型弥漫性星形细胞瘤中，p53基因突变是一个早期的基因改变，在原发Ⅱ级星形细胞瘤中已存在，在复发的Ⅲ、Ⅳ级星形细胞肿瘤中也可找到同样的突变。复发型星形细胞瘤的p53基因突变率高达69%～78%［2,3］。一些基因的改变有与p53基因失活相类似的功能。例如，MDM2基因能反馈调节抑制p53的表达。但是，星形细胞瘤中无MDM2基因的高表达和扩增［4］。又如，细胞周期依赖性激酶抑制素（CDKI）p21，它是p53实现其细胞周期检查点作用的关键分子。p21基因失活与p53基因失活有部分类似的后果，即G1细胞周期阻滞作用消失。但是星形细胞瘤中并没有p21基因突变，p21的表达也没有减低，这提示在星形细胞瘤形成过程中，p53基因的细胞周期调控作用仍存在［5］。

　　PDGF由A、B 2条多肽链组合而成，有3种异构体AA、BB和AB。PDGF受体也有2个异构体PDGF-α和PDGF-β。PDGF受体属于酪氨酸激酶属的受体，当PDGF与其受体结合后，能将促细胞生长的信号传导至细胞核内，促使细胞增殖。有研究发现星形细胞瘤中PDGF的高表达，尤其是PDGF受体的高表达多伴有17号染色体短臂也即是p53基因所在位点的丢失［6］。

　　24%的星形细胞瘤有染色体22q的丢失，提示22q可能存在着一个与星形细胞瘤形成有关的肿瘤抑制基因。该基因的确切位置目前仍不清楚。中枢型神经纤维病基因NF2位于22号染色体的长臂，曾被认为是与星形细胞瘤形成有关的抑癌基因。由于星形细胞瘤并无NF2基因的突变，目前认为该基因与星形细胞瘤形成无直接因果关系［7］。

　　星形细胞瘤生物学行为的特点是瘤细胞分化良好，但呈弥漫性生长，能沿神经纤维向周围正常脑组织浸润，由于手术难以彻底切除，该肿瘤常复发且伴恶性转变（malignant transformation）。根据现有的发现可以推断，p53基因突变使星形细胞瘤逃脱凋亡的命运继续生长。但由于星形细胞瘤的细胞周期调控功能尚健全（这点由p21表达在各级弥漫性星形细胞瘤中非但没有下调却有升高而证实），因此癌细胞生长速度较慢。一些研究发现p53基因失活的直接细胞基因组处于不稳定状态。瘤细胞非整倍体型和基因扩增与p53失活直接相关［8］。基因组的不稳定状态使瘤细胞容易获得更多的基因改变。伴随着基因受累增多，星形细胞瘤发生恶性转变由Ⅱ级演变成Ⅲ级的间变型星形细胞瘤或Ⅳ级的胶质母细胞瘤。

　　星形细胞瘤向间变型星形细胞瘤的转化常伴有染色体9p、11p、13q和19q的丢失。由于这些染色体片段的丢失不存在于Ⅱ级星形细胞瘤中，因此可能含有一些抑癌基因的位点，而这些抑癌基因的丢失恰与星形细胞瘤恶性转变有关。目前已知道染色体9p和13q上分别有p16和RB基因，而13q和19q上的抑癌基因尚未被克隆出来。

　　p16-cdk4/cyclin D1 -pRb是一组重要的细胞周期调控基因。p16通过抑制cdk4与cyclin D1的结合，使Rb蛋白保持非磷酸化状态。只有非磷酸化的Rb才能与E2P紧密结合，cdk4和cyclin D1结合后能促使Rb磷酸化并释放E2F。E2F是重要的转录调节因子。游离状态的E2F能上调一系列促细胞增殖基因的表达。受E2F转录调节的基因有细胞周期素cyclin A和spl基因等。p16-cdk4/cyclin D1-Rb途径中任何一个基因发生改变都足以影响细胞周期的调控。其中最常见的为p16基因失活。它在间变型星形细胞瘤中的发生率约为35%，在胶质母细胞瘤中发生率高达75%～90%［9］。　p16失活的主要机制为纯合和杂合性丢失（homzygous and hemizygous deletion）。基因突变和启动子区5′-CpG岛的甲基化也能导致p16基因失活，但这2种机制在弥漫性星形细胞瘤中较少见。Rb基因的缺失是另一常见的改变，其发生率在间变型星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中约占20%～30%［10］。　此外，cdk4基因扩增和高表达约占10%～15%［11］。有研究发现p16的丢失与Ki-67生长指数的表达呈负相关。有p16缺失的间变型星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的Ki-67指数明显高于p16正常的同级别的星形细胞瘤，这显示p16呈纯合性丢失的肿瘤细胞的生长较有p16表达的肿瘤细胞更活跃［12］。

　　染色体19q片段丢失是胶质瘤，包括间变型少突胶质细胞瘤和弥漫型星形细胞瘤特有且共有的改变。采用多态性微卫星标记（polymorphic microsatellite markers）定位技术，19q13.1位点被确认可能有抑癌基因存在［13］。尽管在19q13.1位点已有2个基因被克隆出来，但是这2个基因的功能和它们是否有抑癌功能的鉴定工作尚未完成。由于间变型星形细胞瘤和胶质母细胞瘤均有11p染色体的丢失，因此11p是又一个可能含有抑癌基因的染色体。通过丢失定位检查已确定该抑癌基因的位置在11p11.5近端粒侧［14］。

　　哺乳动物细胞周期的调节是复杂有序的。G1－S转换主要受p21和p16-cdk4/cyclin D1-Rb控制。p21和p16是2个重要的CDKIs。p21在各级星形细胞瘤中的表达均没有减低和消失，说明它的细胞周期调控作用很有可能是存在的［5］。而p16纯合和杂合丢失在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中很普遍。p16基因对细胞周期有多向性的调控。p16本身蛋白的细胞周期抑制功能需要借助完整的Rb基因。而p16基因除编译p16蛋白外还能编译p19ARF蛋白。p19ARF蛋白也有G1阻滞的作用。p15基因由于与p16基因相毗邻，p16的丢失常伴有p15的丢失。p15蛋白同样也是CDKI，也有细胞周期阻滞的机能。正因为p16有多向性的细胞周期抑制作用，p16丢失的细胞的快速生长使它们获得优势性克隆选择和扩增。p16失活的瘤细胞Ki-67的高生长指数也证实了这一点［13］。星形细胞瘤由Ⅱ级向Ⅲ级转变，瘤细胞在有PDGF和p53基因改变的基础上进一步获得p16基因的失活。间变型星形细胞瘤的瘤细胞不再受细胞周期G1的阻滞，细胞由G1期自由进入S期，组织学形态表现为瘤细胞开始出现核分裂。由于瘤细胞的生长速度加快，手术预后差，复发成为必然。

　　胶质母细胞瘤中最主要的基因改变为第10号染色体的丢失和表皮生长因子受体（EGFR）基因的重组、扩增和高表达。两者的发生率分别为90%和50%左右［10,16］。早期细胞遗传学检查发现多数胶质母细胞瘤只有单条10号染色体。分子生物学多态微卫星标记的检查也证实胶质母细胞瘤有大片段10号染色体的丢失，共有的丢失片段位于10q23-25［15］。目前在10q23-25位点已至少克隆出了4个基因，PTEN、DMBT1、h-neu和LGI1，但只有PTEN基因的功能和抑癌作用得到了证实和公认［16,17］。PTEN蛋白是具有双向功能的磷酸酶，它通过抑制PI3激酶阻止细胞丝氨酸/苏氨酸激酶途径生长信号的传递［18］。EGFR是酪氨酸激酶属的受体，它的基因重组、扩增和高表达使生长信号通过酪氨酸激酶途径传导至细胞核。另有小部分胶质母细胞瘤是Turcot肿瘤综合征肠道肿瘤外的表现型之一，属于与遗传性非息肉型大肠癌相近的多态微卫星小体不稳定型(microsatellite instability, MSI)的肿瘤［19］。这一类型的肿瘤亦称复制错型(replication error, RER+)肿瘤，带有调节DNA复制的基因，如hMLH1和hMSH2的突变。我们最新的研究发现部分发生于儿童的胶质母细胞瘤也有“RER+”的表现型，但是没有发现儿童胶质母细胞瘤有合并肠道肿瘤的现象。其可能性之一为肠道肿瘤迟发于脑的肿瘤。

　　有研究发现，EGFR致癌基因的激活上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达并能促使细胞凋亡［20］。胶质母细胞瘤与间变型星形细胞瘤组织学形态的区别在于细胞分化更差，有细胞坏死和血管内皮细胞的增生。p16-cdk4/cyclin D1-Rb途径失活导致的细胞周期调控的失常、癌基因EGFR的激活和10q的丢失引起的细胞过度增殖使细胞对氧的需求增加，造成血管的增生。细胞过度增殖、坏死和血管增生间的恶性循环是胶质母细胞瘤的特征性改变。因此，组织学检查发现即使只有小灶的细胞坏死，也预示星形细胞瘤进入了胶质母细胞瘤的阶段。

　　长期临床观察显示胶质母细胞瘤有2种类型的临床表现。一是原发型胶质母细胞瘤，发生于老年人，患者平均年龄为60岁，其特点是起病急、病程短，平均小于6个月，预后极差。二是继发型胶质母细胞瘤，发生于较年青的患者，平均年龄为40～50岁，这类患者多有星形细胞瘤或间变型星形细胞瘤的病史，胶质母细胞瘤的形成是WHO分类Ⅱ级或Ⅲ级的星形细胞瘤发生恶性转变的结果。分子生物学研究也证实原发型与继发型胶质母细胞瘤有各自特征性的基因改变。约50%的原发型胶质母细胞瘤有EGFR癌基因的激活。继发型胶质母细胞瘤的特征性基因改变则是p53突变，突变率高达60%～78%［2,9］。原发与继发型的胶质母细胞瘤均有染色体10q的丢失，两者10q的丢失率没有明显差别。然而原发型胶质母细胞瘤p16丢失、PTEN突变和MDM2扩增的发生率则明显高于继发型胶质母细胞瘤［4，21，22］。除上述两型胶质母细胞瘤有不同的基因改变组合外，尚有其他类型的胶质母细胞瘤，如发生于儿童的胶质母细胞瘤和巨细胞型胶质母细胞瘤。它们也有各自的临床特点及基因改变。发生于儿童的胶质母细胞瘤临床表现与原发型胶质母细胞瘤类似，起病急、病程短。与成人多见的胶质母细胞瘤不同的是，除大脑半球是肿瘤的好发部位外，肿瘤也多位于脑干。发生于儿童的胶质母细胞瘤基因的改变有自己的特点，表现为无EGFR基因扩增，但有p53突变，突变发生率为30%～38%。10q23-25和9p21位点均有染色体片段的丢失。丢失的发生率分别为78%和83%。另有20%的肿瘤有微卫星小体不稳定，属于有复制错型RER+基因改变的肿瘤。巨细胞型胶质母细胞瘤是胶质母细胞瘤的一个少见特殊类型，组织学形态瘤细胞呈巨核及多核状，含丰富网状纤维间质。临床起病类似于原发型胶质母细胞瘤，但是患者年龄较轻。这一肿瘤的基因改变与继发型胶质母细胞瘤相近，有较高（75%～90%）的p53突变率。但是无明显的EGFR过度表达，无cdk4基因扩增并且p16基因的失活也少见［23］。

　　近年来的分子生物学研究拓展了我们对疾病发生发展病理机制的认识。许多疾病的发生都是以基因改变为基础。同一疾病可以有不同的基因改变，根据其基因改变的不同又可以进一步做分子生物学水平的分类。实际上肿瘤的基因改变的不同也决定了它对某些治疗反应的不同。如间变型少突胶质细胞瘤，按基因改变分类可分为1p、19q染色体丢失型和9p染色体丢失型，仅有1p丢失的肿瘤对联合化疗(procarbazine, lomustine and vincristine)的治疗效果好。同时有1p和19q丢失的肿瘤不单只对化疗反应良好，而且化疗后患者由病情控制到肿瘤复发的间期也显著延长。相反9p丢失型的间变型少突胶质细胞瘤化疗效果差，患者的预后也差。胶质母细胞瘤对化疗和放疗的效果仍不理想。估计转基因治疗是今后的方向。由于胶质母细胞瘤最常见的基因改变为EGFR扩增和10q丢失，包括PTEN基因的失活，转基因治疗也是集中在逆转这2个基因的改变。此外由于胶质母细胞瘤肿瘤血管增生活跃，抗血管增生的基因治疗也是研究的重点。随着分子生物学技术的不断提高和新技术的介入，如竞争基因组杂交和表达差异显示等，已能快速筛选整个基因组的基因改变。因此，在不久的将来会发现更多的与弥漫性星形细胞瘤有关的基因改变。位于19q和11p上的肿瘤抑制基因也会被克隆出来并得到鉴定。这些研究无疑将为患者预后评估和基因治疗提供有价值的依据。目前分子生物学家和医学家憧憬的未来医学将会是以全基因检查为蓝图，为患者提供更有效的诊断和治疗。

　　作者单位：香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系

　　参考文献

　　1　Rasheed BKA, Mclendon RE, Herndon JE, et al. Alterations of the TP53 gene in human gliomas. Cancer Res, 1994,54:1324-1330.

　　2　Watanabe K, Tachibana O, Sata K, et al. Overexpression of the EGF receptor and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas. Brain Pathol, 1996,6:217-223.

　　3　Cheng Y, Ng HK, Ding M, et al. Molecular analysis of microdissected de novo GBMs and paired recurrent astrocytomas. J Neuropathol Exp Neurol, 1999,58:120-128.

　　4　Biemat W, Kleihues P, Yonekawa Y, et al. Amplification and overexpression of MDM2 in primary (de novo) glioblastomas. J Neuropathol Exp Neurol, 1997,56:180-185.

　　5　Jung JM, Bruner JM, Ruan S, et al. Increased levels of p21 WAF1/Cip1 in human brain tumors. Oncogene, 1995,11:2021-2028

　　6　Hermanson M, Funa K, Koopmann J, et al. Association of loss of heterozygosity on chromosome 17p with high platelet derived growth factor α receptor expresslon in human malignant gliomas. Cancer Res, 1996,56:164-171.

　　7　Ng HK, Lau KM, Tse JY, et al. Combined molecular genetic studies of chromosome 22q and the neurofibromatosis type 2 gene in central nervous system tumors. Neurosurg, 1995,37:764-773.