progress on Study of Techniques for Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells
chem Yongle1,Ling Weijun2,Peng Dongxian 1(1.Zhujiang Hospital ,The First Military Military medical Uniuersity.Guangzhou 5102082 2.The 421 st Hosspital of PLA)
造血干细胞（llematopoietic stem cells,HSC）移植可能使遗传血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴为获得足够量移植用HSC，必须进行大规模的骨髓抽吸或餐周血分离；⑵获得的HSC量有限；⑶HSC输注后产生的成熟细胞的生物动力欠佳，移植后1-3周内并无直接治疗疗效。移植前HSC培养扩增，可解决这些难题。当前主要有两种：⑴细胞因子支持下筛选CD34+细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。下面就HSC培养的发展、HSC扩增方法以及展望等作一综述。
1 早期HSC培养及启示
1半固体培养体系 1966年，Bradley等[1]介绍了一种新的半固体培养方法（即集落形成法）用以培养骨髓。此法利用胶体凝胶作支托，没有细胞微环境，只能维持造血祖细胞在1-2周内形成细胞集落，不能支持HSC的生长或分化。即使没法加入营养物、生长因子等，培养时间也只能延长到2-4周。由半固体培养体系的期限性可推断，早期原始HSC不能在这样的培养体系中存活、增殖。
2Dexter培养体系 Dexter等[2]于1977年建立了骨髓液体培养体系。此培养法基础是建立一骨髓基质细胞支持层（包括成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和网状细胞等），形成二维空间结构，培养体系不单提供了营养、细胞因子，而且提供了类似于体内的细胞-细胞关系，使此法纤维造血8-12周[3]。极限稀释法技术证明，在Dexter培养体系中，前造血祖细胞在培养第一周前已开始减少[4]。应用细胞免疫表型分析提示，该体系培养的骨髓CD34+、CD38-细胞不能更新复制[5]。早期造血细胞体外培养扩增方法的研究启示：HSC细胞可在体外培养，但两种培养方法均没有建立适合其体外造血的微环境。寻求建立，一个合适的人HSC培养体系是研究的关键。
2 目前HSC的体外扩增方法
理想的SHC培养方法要求既能最大限度地扩增各阶段的造血细胞，又能维持甚至扩增HSC。目前较为成功的人HSC体外扩增方法主要有两种：⑴细胞因子支持十筛选CD34+细胞的体外扩增；⑵基质支持下的灌注培养。
2.1 细胞因子支持下筛选CD34+细胞培养
2.1.1 HSC的特性 HSC没有任何形态方面的特征，也没有独特的免疫表型迄今尚无直接检测的方法。HSC只能通过脾结节形成法检测，也可通过检测高增殖潜能集落形成单位（CFU-HPP）长期培养启动细胞（LTC-IC）反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123荧光呈阴性或低强度，对4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的细胞群体，早期的造血细胞大部分处于G0/G1期，启动慢，但扩增持续时间长，扩增倍数高，造血细胞产量高。较成熟造血细胞启动快，短期扩增倍数高，维持时间短，产物多是成熟细胞，造血祖细胞产量少。
2.1.2 细胞因子的造血调节根据细胞因子对造血细胞不同的作用阶段将其分为：⑴特异性细胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；⑵无系特异性细胞因子：作用于分化状态的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要维持处于G0期之外所有HSC的生存、增生；⑶G0期作用细胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，维持早期HSC的存活或促其分化扩增：⑷抑制血细胞生成的细胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特异性，TGF-β主要抑制早期血细胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖[6]。
2.1.3 扩增策略 目前细胞因子支持下筛选CD34+细胞体外扩增方法研究最为普遍。实验证明，筛选早期HSC剔除成熟的CD34-细胞进行扩增，可获得更好的效果[7]。单独应用一个细胞因子扩增人HSC效果不佳，多个因子合理组合才能获得理想的扩增效果。一般认为，生长因子合理组合应包括：⑴抑制细胞残死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等⑵刺激早期造血细胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；⑶定向扩增刺激因子，如G-CSF和EPO等[9]。
Moore[10]用delta培养法培养骨髓CD34+细胞，发现未用因子时CFU-GM迅速消失；而单用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子时，14天培养CFU-GM维持不变或只扩增2-8倍；用SCF/IL-3联用另3个或3个以上因子组合扩增效果更好。多数人认为合适的细胞因子组合为IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17扩增经动员外周血（MPB）CD34+细胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以扩增非MPBCD34+细胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]则认为SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最适于外周血CD34+细胞扩增，12-14天培养，扩增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而扩增脐血CD34+、CD45RA low、CD77low的CFU-GM（70倍）和BFU-E（55倍）的最好因子组合分别为SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，扩增两者的最佳组合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分无IL-6R表达，IL-6/Sil-6R复合体激发HSC表达gp130，启动HSC自我复制的信号传递，而c-Kit/SCF是HSC自我自制扩增的另一信号传递途径。无血清条件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人脐血CD34+细胞，细胞总数和造血祖细胞数随Sil-6R增加而明显增加，培养14天，
CFU-GM扩增近70倍，集落中除了几个CFU-M和BFU-E外，有大量（≥60%）的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情况下，培养7天，14天，分别扩增CFU-Mix60倍和70倍。由此说明，细胞因子促进造血是通过与期受体结合引起信号传递而起作用的，为体外造血研究开创了新的思路。
细胞因子支持下筛选CD34+细胞扩增法有以下优越性：⑴条件容易控制，产量稳定；⑵无异体基因污染。缺点是：目前还无可完全代替基质的细胞因子，单用因子不能维持体外长期造血；需不断加入因子，费用昂贵，不能大规模使用。
2.2 基质细胞支持的灌注培养
此培养方法提供HSC一个接近于体内的造血环境，能扩增各阶段的造血细胞，并维持甚至扩增原始HSC，称原始H
